Een onderzoeksinstituut dient zijn proefdieren bij speciale fokbedrijven aan te schaffen, of zelf te fokken op zijn/haar onderzoeksinstituut. Het gebruik van huisdieren in dierproeven is sinds 1977 wettelijk verboden. Voor betrouwbare resultaten is het van belang dat proefdieren genetisch zoveel mogelijk op elkaar lijken en onder dezelfde omstandigheden opgroeien. Bij fokbedrijven kunnen zelfs proefdieren worden besteld met dezelfde genen en/of (menselijke) erfelijke ziektes. 

In de Wet op de dierproeven wordt gesproken over de mate van 'ongerief' bij een proefdier. Proefdiervrij noemt het liever bij de echte naam: leed. Volgens de wet ervaart een proefdier leed als het zichtbaar ongemak ervaart in de situatie waarin het zich bevindt, of ziek is en/of pijn lijdt.

Het leed wat een proefdier ervaart wordt onder andere veroorzaakt door de behandeling tijdens de proef (bijvoorbeeld als een dier ziek gemaakt wordt), door de opsluiting onder onnatuurlijke omstandigheden of door het vaak vastpakken door mensen. Door de onnatuurlijke omgeving ervaart elk proefdier per definitie veel leed.

Langs de wettelijke meetlat ondervonden proefdieren in 2008 de volgende mate van leed:

Ervaren leed	2008	2007
Gering	194.597	204.040
Gering/matig	164.881	172.762
Matig	144.834	150.289
Matig/ernstig	52.658	51.890
Ernstig	20.972	18.558
Zeer ernstig	181	66
Totaal	578.123	597.605
Bron: Zo doende

Maar weinig dieren overleven een dierproef. Als het proefdier de proef zelf al overleeft dan is de kans groot dat de onderzoeker het dier alsnog afmaakt. Zo kan hij de effecten die de proef op de organen heeft gehad onderzoeken.
De kans dat een proefdier opnieuw in een andere proef gebruikt wordt, is zeer gering. De effecten van de eerste proef zouden de tweede proef kunnen beïnvloeden. Daarom vinden veel proefdieren na de dierproef de dood.
Voor het doden van proefdieren worden verschillende methoden gebruikt. Muizen en ratten worden (soms eerst verdoofd) in een bak met kooldioxide geplaatst, waarna de dieren stikken. Ook worden de dieren verdoofd en via de halsslagader verbloed of onthoofd. Grotere dieren worden vaak met een overdosis narcosemiddel gedood. Nadat de gedode dieren onderzocht zijn, worden ze vernietigd.

Voor de huisvesting van proefdieren bestaan Europese richtlijnen. Deze richtlijnen verschillen per diersoort. Muizen en ratten worden bijvoorbeeld vaak in kunststofkooien met een metalen roosterdak ondergebracht. Deze kooien worden in opstellingen in speciale kamers geplaatst. De kunststofkooien hebben afmetingen van 45x32x18 cm. Afhankelijk van de grootte van de dieren worden daarin ongeveer 10 muizen of 2 tot 3 ratten ondergebracht. Voor honden moet de minimum-kooimaat volgens de Europese richtlijn 2,8 m2 per dier zijn. Waar mogelijk worden proefdieren met soortgenoten gehuisvest.